Padronização de técnicas fundamentais para ensaios ex vivo de invasão de eritrócitos por Plasmodium Vivax (2023)
- Authors:
- Autor USP: BARROS, LUIZA BARBOSA - FCF
- Unidade: FCF
- Subjects: MALÁRIA; ERITRÓCITOS
- Keywords: Plasmodium vivax
- Language: Português
- Abstract: INTRODUÇÃO: O estabelecimento da cultura de Plasmodium vivax é elementar para o desenvolvimento de testes moleculares e vacinas. Apesar da definição da cultura de curto prazo sucedida, a reprodutibilidade ainda é um desafio a ser superado. A padronização do protocolo servirá para futuros estudos que envolvem ensaios de invasão. OBJETIVO: Estabelecer um protocolo de cultura ex vivo de P. vivax. Ademais, pretendemos otimizar os ensaios de invasão ex vivo utilizando amostras criopreservadas de P. vivax e reticulócitos humanos enriquecidos provenientes do sangue periférico de indivíduos saudáveis. MATERIAL E MÉTODOS: Para obter reticulócitos do sangue de doadores saudáveis, iniciamos pela padronização de protocolos para aprimorar o enriquecimento de reticulócitos. Incluímos ou omitimos um passo de lavagem com solução de KCl de amostras de sangue leucodepletadas antes da centrifugação em gradiente de Percoll e comparamos diferentes volumes de sangue e de Percoll (3 mL ou 5 mL de cada). Além disso, testamos as concentrações de hemácias (hematócrito) para o protocolo de enriquecimento. Também comparamos dois corantes fluorescentes, Vybrant DyeCycle Green e Violet, para a quantificação da parasitemia por citometria de fluxo utilizando uma linhagem de Plasmodium falciparum para a padronização desta técnica. RESULTADOS: Mostramos que as suspensões de hemácias com 30% de hematócrito que foram submetidas a um passo de lavagem permitiram um melhor enriquecimento utilizando a centrifugação em gradiente de Percoll, começando com pequenos volumes de amostra (3 mL). É importante salientar que os reticulócitos sobrevivem a períodos relativamente longos (até 8 dias) de armazenamento a 4 ºC. Em seguida, mostramos que o corante Vybrant DyeCycle Green nas diluições 1:2500, 1:5000 ou 1:10000 permitiu umamelhor quantificação dos parasitas do que o Vybrant DyeCycle Violet. CONCLUSÃO: A técnica de enriquecimento de reticulócitos foi padronizada. Determinamos o hematócrito ideal a ser utilizado e a necessidade de etapas de lavagens para um melhor enriquecimento de reticulócitos. Além disso, conseguimos quantificar a parasitemia por citometria de fluxo utilizando pequenos volumes da cultura marcada com o corante Vybrant DyeCycle Green. Os ensaios de invasão não puderam ser realizados porque obtivemos quantidades muito baixas de estágios assexuados viáveis de P. vivax no sangue após o descongelamento de hemácias infectadas criopreservadas, mas o estágio está definido para experimentos futuros
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ABNT
BARROS, Luiza Barbosa. Padronização de técnicas fundamentais para ensaios ex vivo de invasão de eritrócitos por Plasmodium Vivax. 2023. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2023. Disponível em: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/f2ec6ca2-e0c3-4552-858f-361be4a31b62/TCC_Luiza_Barbosa_Barros.pdf. Acesso em: 15 mar. 2025. -
APA
Barros, L. B. (2023). Padronização de técnicas fundamentais para ensaios ex vivo de invasão de eritrócitos por Plasmodium Vivax (Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/f2ec6ca2-e0c3-4552-858f-361be4a31b62/TCC_Luiza_Barbosa_Barros.pdf -
NLM
Barros LB. Padronização de técnicas fundamentais para ensaios ex vivo de invasão de eritrócitos por Plasmodium Vivax [Internet]. 2023 ;[citado 2025 mar. 15 ] Available from: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/f2ec6ca2-e0c3-4552-858f-361be4a31b62/TCC_Luiza_Barbosa_Barros.pdf -
Vancouver
Barros LB. Padronização de técnicas fundamentais para ensaios ex vivo de invasão de eritrócitos por Plasmodium Vivax [Internet]. 2023 ;[citado 2025 mar. 15 ] Available from: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/f2ec6ca2-e0c3-4552-858f-361be4a31b62/TCC_Luiza_Barbosa_Barros.pdf
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