Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli (2019)
- Authors:
- USP affiliated author: PIRES, MANUELLA CAZELATO - FMRP
- School: FMRP
- Subjects: STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE; VACINAS; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; CROMATOGRAFIA
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A bactéria Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno humano que causa doenças graves, com elevadas taxas de mortalidade. As vacinas pneumocócicas atuais têm como base os polissacarídeos capsulares, mas seu custo de produção é elevado e sua cobertura é limitada aos sorotipos incluídos na formulação. Assim, vacinas proteicas têm sido propostas como alternativa. Dentre os candidatos estudados destaca-se a pneumolisina (Ply), toxina hemolítica que se liga ao colesterol da membrana, oligomerizando-se e gerando poros que lisam as células do hospedeiro. Ply também liga-se ao toll-like receptor 4, desencadeia a ativação do complemento pela via clássica dependente de anticorpos, porém inespecíficos, e recentemente foi demonstrado que os poros formados ativam o inflamassoma NLRP3. Portanto, Ply tem grande potencial vacinal e imunomodulador, por isso, devido à sua toxicidade, foi geneticamente destoxificada para emprego em vacinas. Este projeto propõe estabelecer o processo de purificação da proteína recombinante destoxificada (PdT) para que possa futuramente ser avaliada para formulação de uma nova vacina pneumocócica baseada em nanopartículas para administração em pó. PdT foi clonada em Escherichia coli sem qualquer tag de afinidade para evitar as caras e relativamente ineficientes etapas de remoção da tag. O cultivo foi em biorreator com meio de autoindução livre de compostos de origem animal, com as especificações de produção já obtidas em processos anteriores, para produção da PdT . Para o processo de purificação as seguintes etapas foram avaliadas: separação e lise celular, remoção de debris e impurezas do lisado, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, multi-modal e de interação hidrofóbica. O processo de purificação com os melhores resultados foi o seguinte: lise em tampão bis-tris 10 mM pH 7,0, centrifugaçãoa 17.000 g por 2 h, cromatografia de troca aniônica com aplicação da amostra em pH 9,5 e eluição por gradiente crescente de NaCl, cromatografia de interação hidrofóbica com eluição por gradiente decrescente de NaCl. As etapas cromatográficas precisam ser otimizadas para alcançar pureza ≥95% para usar PdT na formulação das nanopartículas
- Imprenta:
- Place of publication: Ribeirão Preto
- Date published: 2019
-
ABNT
PIRES, Manuella Cazelato. Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli. 2019. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019. Disponível em: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/07d099ab-5638-48d3-992d-66ffa74fe372/TCCMANUELLACAZELATOPIRES____-desbloqueado.pdf. Acesso em: 24 abr. 2024. -
APA
Pires, M. C. (2019). Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli (Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/07d099ab-5638-48d3-992d-66ffa74fe372/TCCMANUELLACAZELATOPIRES____-desbloqueado.pdf -
NLM
Pires MC. Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli [Internet]. 2019 ;[citado 2024 abr. 24 ] Available from: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/07d099ab-5638-48d3-992d-66ffa74fe372/TCCMANUELLACAZELATOPIRES____-desbloqueado.pdf -
Vancouver
Pires MC. Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli [Internet]. 2019 ;[citado 2024 abr. 24 ] Available from: https://bdta.abcd.usp.br/directbitstream/07d099ab-5638-48d3-992d-66ffa74fe372/TCCMANUELLACAZELATOPIRES____-desbloqueado.pdf
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